BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN UJI AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH MANGGIS

BAB III

METODE PENELITIAN

A.                Kerangka Konsep

1.      Desain Penelitian

Uji aktifitas antibakteri ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana Linn) terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dilakukan melalui metode eksperimental.

Penelitian diawali dengan penyiapan sampel ekstrak etanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana Linn.), penyiapan suspensi bakteri Staphylococcus aureus, pembuatan kontrol positif Sefadroksil 100 ppm, kontrol negatif etanol 95% dan pembuatan media nutrient agar.

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah cakram kertas. Dilakukan pengujian dengan etanol 95% sebagai kontrol negatif dan Sefadroksil sebagai kontrol positif, dan ekstrak etanol kulit buah manggis dengan konsentrasi 5 µl, 10 µl, 15 µl dan 20 µl sebagai sampel uji. Kemudian diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 jam. Parameter yang diukur adalah diameter daerah bening yang menunjukkan daerah hambatan terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus.

Data yang diperoleh dari hasil daya hambat kulit buah manggis terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus kemudian diuji kebermaknaan dengan menggunakan SPSS versi 16 dengan Uji ANOVA Satu Arah.

2.      Populasi

Populasi pada penelitian ini adalah buah manggis yang diperoleh dari salah satu pasar buah di daerah Bandung.

3.      Sampel

Sampel pada penelitian ini adalah bagian kulit buah manggis yang diujikan pada bakteri Staphylococcus aureus.

4.      Devinisi Operasional

Pengujian aktivitas antibakteri adalah teknik untuk mengukur berapa besar potensi atau konsentrasi suatu senyawa dapat memberikan efek bagi pertumbuhan bakteri.

5.      Variabel Penelitian

a)      Variabel Dependent : Diameter daerah bening yang menunjukan aktivitas antibakteri terhadap pertumuhan bakteri Staphylococcus aureus.

b)      Variabel Independent : Konsentrasi ekstrak etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana Linn.) terhadap pertumbuhan bakteri Staphylicoccus aureus.

B.                 Instrumen Penelitian

1.    Alat yang digunakan

Cawan petri, cawan penguap, erlenmeyer 250 ml, Labu ukur 100 ml, cakram kertas (kertas Whatman), autoklaf Delixi, spektrofotometer (Shimadzu), oven (Memmert), Laminar Air Flow (LAF), jangka sorong, colony counter (untuk menghitung koloni),  beaker glass 600 ml, mikroskop, pH meter, timbangan analitik, kompor listrik, pinset, cover glass, objek glass, jarum ose, bunsen, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet volume 1 ml, Micropipet,  Incubator type 41900 (thermolyne), penangas air (Waterbath), dan kapas lidi steril.

2.    Bahan yang digunakan

Nutrient agar (OXOID^®), Kulit buah manggis (Garcinia mangostana Linn), Sefadroksil  500 mg, etanol 95% (Central Kimia), aquadest, Gram A (Kristal violet), Gram B (Lugol iodine), Gram C (etanol:aseton), Gram D (Safranin), pereaksi FeCl₃ 1%, serbuk Mg, larutan HCl 2N, larutan  amilalkohol, gelatin 1%, biakan bakeri Staphylococcus aureus.

C.                Teknik Pengumpulan Data dan Analisa Data

Pengumpulan data dilakukan melalui serangkaian prosedur penelitian untuk kemudian dilakukan analisa dari data yang didapatkan.

1.    Sterilisasi Alat dan Bahan

Pada sterilisasi alat, semua alat yang mudah pecah atau yang berbahan gelas dan kaca dibungkus kertas. Kemudian sterilisasi dalam oven pada suhu 180^oC selama 2 jam.

Pada sterilisasi bahan seperti aquadest steril dan Nutrien Agar disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121^oC selama 15 menit.

2.    Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis

Penyiapan ekstrak etanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana Linn.) dilakukan dengan pengeringan sampel kulit buah manggis yang telah dirajang. Timbang 100 gram simplisia kulit buah manggis dan masukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml, tambahkan 300 ml etanol 95% (1:3) hingga simplisia terendam. Didiamkan selama ± 48 jam. Saring hasil maserasi, pisahkan ampasnya. Setelah itu, maserat dikentalkan diatas penangas air pada suhu ± 40^oC sampai diperoleh ekstrak kental.

3.    Evaluasi Ekstrak dan Uji Kualitatif

a.       Uji Organoleptis

Bau, bentuk, rasa, warna dan pH dari ekstrak kental tersebut.

b.      Uji kualitatif

a.         Identifikasi Flavonoid

1)   Sejumlah kecil ekstrak kulit buah manggis dimasukkan kedalam tabung reaksi.

2)   Ditambahkan kedalamnya serbuk magnesium (Mg) dan asam klorida (HCl 2N).

3)   Campuran diatas tangas air lalu disaring.

4)   Kedalam filtrat ditambahkan amil alkohol kemudian dikocok kuat.

5)   Amati perubahan warna yang terjadi pada larutan, jika terbentuk warna kuning hingga merah yang tertarik oleh amil alkohol maka simplisia mengandung senyawa flavonoid.

b.        Identifikasi Saponin

1)   Sejumlah kecil ekstrak kulit buah manggis dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan air.

2)   Larutan dipanaskan diatas tangas air, lalu disaring.

3)   Filtrat dimasukan kedalam tabung reaksi dan dikocok kuat secara vertikal selama ±5 menit.

4)   Terbentuknya busa yang mantap dan tidak hilang selama 30 menit dengan tinggi busa minimal 1 cm menunjukkan adanya saponin.

c.         Identifikasi Tanin

1)   Sejumlah kecil ekstrak kulit buah manggis, tambahkan aquadest secukupnya dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian dipanaskan ditangas air.

2)   Larutan simplisia disaring, kemudian filtrat ditambahkan larutan gelatin 1%.

3)   Amati larutan dengan seksama, jika terbentuk endapan berwarna putih maka dalam simplisia tersebut terkandung senyawa tanin.

4.       Pembuatan Nutrient Agar

Media agar dibuat sebagai media pertumbuhan bakteri yang akan diteliti pertumbuhannya. Pertama timbang 2,8 gram Nutrient Agar, masukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, tambahkan aquadest hingga 100 ml. Aduk diatas penangas air hingga larut, setelah itu strerilisasi dalam autoklaf dengan suhu 121°C selama 15 menit.

5.    Pembuatan Baku Pembanding Positif

Baku banding positif yang digunakan adalah sefadroksil 100 ppm. Bahan baku sefadroksil yang telah ditimbang yaitu 100 mg  kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml dilarutkan dengan aquadest steril hingga tanda batas, kemudian disaring dan pipet 5 ml di masukkan kedalam labu ukur 50 ml tambahkan aquadest steril sampai tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi 100 ppm.

6.    Pembuatan Suspensi Bakteri

Suspensikan beberapa ose bakteri Staphylococcus aureus ke dalam 100 ml aquadest steril. Atur kekeruhan hingga diperoleh transmitan 25% terhadap blanko pada panjang gelombang 580 nm.

7.    Pengecatan Gram Bakteri Staphylococcus aureus

Salah satu sisi gelas benda dibersihkan dengan alkohol hingga bebas lemak, flambir diatas nyala api, buat smear bakteri pada gelas benda secara aseptik keringkan kemudian fiksasi di atas nyala api. Tetesi smear bakteri tersebut dengan cat Gram A (kristal violet) dan biarkan selama 1 menit kemudian buang zat warna berlebih lalu bilas dengan air. Tetesi kembali dengan cat Gram B (Lugol Iodine) dan biarkan selama 1 menit kemudian buang zat warna lalu bilas dengan air. Cuci dengan zat Gram C (etanol: aseton) selama 30 detik sampai seluruh zat warna larut, lalu bilas dengan air. Tetesi kembali dengan cat Gram D (safranin) selama 1 menit, buang cat berlebih dan bilas dengan air lalu keringkan. Amati preparat tersebut dengan mikroskop. Jika bakteri gram positif akan berwarna ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.

8.    Penentuan Jumlah Bakteri

Langkah awal dalam penentuan jumlah bakteri ialah membuat media agar dan menyiapkan suspensi bakteri serta melakukan pengenceran pada konsentrasi 10² sampai 10¹⁰. Kemudian campur 20 ml media agar pada suhu ± 40⁰C dengan  1 ml suspensi bakteri kedalam cawan petri steril, inkubasi dalam inkubator dengan suhu 35⁰C selama 24 jam, setelah 24 jam hitung pertumbuhan jumlah koloni bakteri, syarat jumlah koloni minimal yang dihitung adalah antara 30 sampai 300 koloni. Bila koloni lebih dari 300 koloni, maka suspensi bakteri Staphylococcus aureus harus diencerkan kembali dan lakukan penentuan jumlah bakteri.

9.    Penentuan Aktivitas Antibakteri

Pertama buat lempeng agar dan biarkan memadat, pipet 1 ml suspensi bakteri, ratakan dengan kapas lidi steril, kemudian letakkan 6 buah kertas saring yang telah disterilkan. Pada kertas saring pipetkan etanol 95% sebanyak  5 ml, Sefadroksil 100  ppm dengan konsentrasi 5 μl, ekstrak etanol kulit buah manggis dengan konsentrasi  5µl, 10 µl, 15 µl  dan 20 µl, lalu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37^oC selama 24 jam. Kemudian tentukan daya hambat ekstrak etanol kulit buah manggis dengan melihat dan mengukur diameter daerah bening pada lempeng agar yang telah dibiakan bakteri.

10    Pengolahan Data

Data yang didapat melalui penelitian kemudian diuji kebermaknaannya dengan menggunakan SPSS versi 16 yaitu Uji ANOVA Satu Arah. Teknik ini digunakan untuk menguji apakah terdapat perbedaan yang bermakna antara keenam perlakuan terhadap sampel.